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Innanzitutto serve un po' di teoria...

1) La beta-galattosidasi è un enzima che trasforma il lattosio in glucosio. L'enzima però non è specifico solo x il lattosio, ma può agire anche su composti simili, come ad esempio X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galattopiranoside) che viene idrolizzato dalla beta-gal rilasciando un composto blu.

2) La beta gal ha due domains principali, chiamati alfa e omega necessari perchè possa funzionare.

Ora, se prendi un E.Coli mutante che esprime solo il frammento omega questo non potrà idrolizzare X-Gal (o chi per esso). Se però lo trasformi con un vettore che esprima il frammento alfa, hai un fenomeno detto alfa-complementazione, per cui i due domini, anche se espressi separatamente, possono interagire e funzionare, come se avessi la beta-gal completa.

Il tipico plasmide che esprime il frammento alfa è il pUC. Il frammento è espresso sotto il controllo del promotore lac, quindi devi mettere un induttore per avere trascrizione: a tale scopo si usa di solito IPTG (isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside).

Il plasmide ha anche il gene x la resistenza all'ampicillina, per selezionare i mutanti.

Quindi, cosa succede:

hai il tuo ceppo che esprime solo omega.

1) se lo piastri su terreno con ampicillina muore tutto! [:)]

2) se trasfetti con pUC e piastri su ampicillina ti rimarranno le colonie che hanno preso il plasmide.

3) se nel terreno, oltre all'ampicillina, ci metti anche X-Gal e IPTG le colonie saranno tutte blu.

E adesso viene il bello!

Il pUC ha il polylinker esattamente all'interno del frammento alfa. Quindi, se tu cloni qualcosa li dentro e trasfetti i tuoi bei batteriacci, poi li piastri con amp, X-Gal e IPTG vedrai:

- colonie blu che avranno il plasmide ma non il gene clonato all'interno

- colonie bianche che avranno il plasmide con il gene clonato all'interno

ciao!